L’origine du monastère date du xiiie siècle, lorsqu’un berger de Cáceres appelé Gil Cordero, découvrit sur la berge de la rivière Guadalupe une statue de la Vierge qui avait apparemment été cachée par les habitants de la région pour la préserver des envahisseurs Maures en 714. Une chapelle fut d’abord édifiée à l’endroit de cette découverte. Le roi Alphonse XI qui visitait fréquemment la chapelle, était venu y invoquer Santa Maria de Guadalupe à la veille de la Bataille de Tarifa (ou « Bataille de Rio Salado »), lors de la Reconquista.
Après avoir gagné cette bataille, dont il attribua la victoire à l’intervention de la Vierge, il fit de la chapelle un sanctuaire royal et fit commencer un important programme de construction.
En 1389, les moines Hiéronymites firent du monastère leur résidence principale.
Le monastère est associé avec le « Nouveau monde » où « Notre Dame de Guadalupe » est révérée dans la basilique mexicaine de Guadalupe et dans d’autres lieux. C’est en ce lieu de l’Extremadura que Christophe Colomb fit son premier pèlerinage après sa découverte de l’Amérique en 1492 et ce fut dans ce lieu qu’il vint remercier pour cette découverte. En son hommage, il baptisera lors de son deuxième voyage Santa Maria de Guadalupe de Estremadura l’île aujourd’hui connue sous le nom de Guadeloupe.
Même après que les moines eurent fondé le fameux monastère d’Escorial, plus proche de Madrid, Santa Maria de Guadelupe conserva la protection royale. Il resta le plus important cloître d’Espagne jusqu’à la sécularisation des monastères en 1835. Au xxe siècle, le monastère fut réanimé par l’ordre des Franciscains et le pape Pie XII fit du lieu une « basilique papale mineure » en 1955.
